锐谈 | Metab. Eng：大连化物所实现二萜香紫苏醇高效生物合成

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发布时间：2023-07-31 11:08
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龙涎香，古人认为是龙的口水，其实是从抹香鲸中提取的，是非常稀有的传世收藏品以及顶级香水的定香剂，价比黄金！但抹香鲸濒临灭绝。近来的研究发现，二萜物质--香紫苏醇可以合成龙涎香醚，此外，香紫苏醇在医药和农药领域也具有重要的生物活性。

目前，香紫苏醇主要是从植物中提取，但该方法存在受制因素多、分离纯化困难等缺点，难以实现香紫苏醇的稳定供应。通过引入异源萜类合成途径并改造内源代谢途径，构建微生物细胞工厂，有望实现香紫苏醇的高效合成。

中国科学院大连化学物理研究所周雍进团队以酿酒酵母为底盘，通过构建优化二萜香紫苏醇生物合成途径并对中心代谢途径进行全局调控，实现了香紫苏醇的高效合成，产量达到11.4g/L。据作者了解，这一产量是目前已有报道中二萜类化合物的最高产量。相关成果以"Engineering yeast for high-level production of diterpenoid sclareol"为题发表在Metabolic Engineering杂志上。

主要研究内容包括：

1. 改造二萜合成酶提高产量。

通过在酵母基因上融合 Tps 和 Lpps 两种合成酶（鼠尾草中的 I 类和 II 类二萜合成酶），将香紫苏醇的产量提高 6.7 倍。并且通过在 Tps-Lpps 的 N 端连接麦芽糖结合蛋白（MBP）提高酶的稳定性，将香紫苏醇的产量提高了 43%。

2. 通过将整个代谢路径分为三个模块（供应乙酰辅酶 A 的中心代谢途径、类异戊二烯生物合成途径和调节因子模块），系统改造细胞代谢路径增加香紫苏醇的产量。

为了减少繁琐的基因改造步骤，该团队通过重新调整底盘细胞的中心代谢尝试将细胞代谢从游离脂肪酸（FFA）的生物合成转化为合成二萜化合物。这一转化可以节省 18 个基因操作步骤，缩短构建基于底盘菌株构建多功能细胞工厂的时间。

研究显示，在底盘中，过表达 tHMG1、SpHMGR 和 ERG20* 基因，香紫苏醇的产量为 6.4 mg/L，比对照菌株 CXM21 提高了 5.2 倍。进一步过表达 ERG10 和 HMG2* 基因，香紫苏醇的产量为 49.1 mg/L，比对照菌株 CXM22 提高了 22 倍。与野生型相比，增强底盘细胞的中心代谢能更明显改善类异戊二烯生物的合成。

基于构建的底盘细胞，研究团队全面设计了类异戊二烯途径以进一步改善香紫苏醇的生物合成，通过基因拷贝增加与删除尝试提高产量。比如说，在菌株 SCX32 中，表达两个 HMG2* 基因可以将香紫苏醇产量提高到 120.3 mg/L；在菌株 SCX38 中，过表达融合基因 BTS1-PaGGPPS 使香紫苏醇产量提高到 347.4 mg/L。

研究团队还评估了优化调节因子对香紫苏醇产量的影响。

3. 通过工程菌株的代谢谱分析了每个模块对合成香紫苏醇的影响。

在野生型前提下，优化类异戊二烯途径（菌株 CXM17）可提升产量至 13.4 mg/L/O D600，进一步优化调节因子（菌株 CXM18）可将产量提高 2.6 倍。在改造核心代谢的基础上，优化类异戊二烯通路（菌株 SCX38）和设计调控因子（菌株 SCX42）分别比菌株 CXM17 和菌株 CXM18 提高了约 2 倍。

这些数据表明，这三个模块具有协同效应，可为香紫苏醇生物合成提供高效的代谢通道。进一步的数据表明，重组代谢路径对香紫苏醇的生物合成具有积极影响。

4. 研究团队还对工程菌株进行了转录组分析，数据表明，优化类异戊二烯通路对整个代谢网络有轻微影响，而设计中心代谢和调节因子会促进细胞代谢的全局调整。此外，除了中心代谢外，还有一些隐藏的基因也对外部代谢的重新调整有反应，有助于促进目标产物的生物合成。

5. 该团队还评估了上述方式的生产潜力，他们在摇瓶和生物反应器中对用于香紫苏醇生产的菌株进行了补料分批发酵。

试验过程中，为避免补充组氨酸和尿嘧啶，研究团队通过补充营养缺陷标记URA3 和 HIS3 构建了原养型菌株，这是一种营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表现型上与野生型相同。接下来，优化了摇瓶中的补料培养基，最佳菌株 SCX42-LAC1-OYE3-UH 的补料分批发酵产生了 11.4 g/L 的香紫苏醇，这是迄今为止文献中报道过最高的二萜化合物产量。