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锐谈 | ACS Synth. Biol.: 高产(R) - 1,3-丁二醇的大肠杆菌代谢工程研究

锐谈 | ACS Synth. Biol.: 高产(R) - 1,3-丁二醇的大肠杆菌代谢工程研究

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  • 发布时间:2023-06-26 15:37
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锐谈 | ACS Synth. Biol.: 高产(R) - 1,3-丁二醇的大肠杆菌代谢工程研究

【概要描述】

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1,3-丁二醇(1,3-BDO)是一种重要的C4平台化学品,广泛用作化妆品中的溶剂,也是合成香料、信息素和药物的关键中间体。

本文通过不同代谢工程策略组合,提高大肠杆菌生产(R)-1,3-BDO的能力。

包括:

(1)关键途径酶的筛选;

(2)增加辅因子NADPH的供应;

(3)研究代谢途径,减少副产物的形成;

(4)通气条件优化;

本文中5L生物反应器发酵32h,积累13.4g/L(R)-1,3-BDO,产率提高到0.57mol/mol葡萄糖,理论产率的60%。迄今为止文献中报道的最高产量。

采用基于3-羟基丁酰CoA的(R)-1,3-BDO生产途径,乙酰辅酶A通过四步反应转化为(R)-1,3-BDO,其中前两步已经通过生产3-羟基丁酸酯(PHB)用于实际应用,可以直接利用。

1.乙酰辅酶A乙酰转移酶将两个乙酰辅酶A单元缩合形成乙酰乙酰辅酶A;

2.乙酰乙酰CoA还原酶将乙酰乙酰辅酶还原为3-羟基-丁酰CoA。

文章中选择编码乙酰乙酰CoA乙酰转移酶的phaA基因和编码(R)-3-羟基丁酰CoA还原酶的phaB基因,来完成第一二步的代谢途径。
与此同时引入剧报道能有效减少醛的生成的在大肠杆菌中过度表达的内源性基因yqhD。
3.将3-羟基-丁酰辅酶A还原为3-羟丁醛(3-HB)和1,3-BDO。

这一步采用筛选不同的CoA酰化醛脱氢酶方式来提高产率。

图为不同脱氢酶对应基因,发现在bld引入L273T突变显著增加(R)-1,3-BDO产量,并且此突变能够增加对NADPH的结合亲和力。

同时文献中对发酵产物进行产物测定,发现发酵产物积累了3-HB,少量乙酸盐和琥珀酸盐,乙醇等。

为了减少副产物生成,敲除代谢3-HB的yciA及tesB基因,但是3-HB的积累还是没有显著减少。
因此考虑通过羧酸还原酶(CAR)和醇脱氢酶两步还原将副产物3-HB转化为需要的产物1,3-BDO,同时羧酸还原酶(CAR)还为整个生产途径提供驱动力。

最终在Trc启动子调控下,两个CAR基因,yqhD基因,sfp基因在质粒pCDFDuet-1上表达,分别转入菌株W-12中。得3-HB积累量显著减少的菌株,证明副产物减少策略的有效性。

原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00109

作者:祭

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