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锐谈 | NAR:Ago——gDNA介导的大肠杆菌基因组编辑工具

锐谈 | NAR:Ago——gDNA介导的大肠杆菌基因组编辑工具

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  • 发布时间:2023-04-26 10:36
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锐谈 | NAR:Ago——gDNA介导的大肠杆菌基因组编辑工具

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许多原核Ago蛋白(prokaryoticargonaute,pAgo)通过小DNA作为向导序列介导DNA干扰。最近有研究表明来自丁酸梭菌的CbAgo可诱导同源序列之间的DNA干扰,CbAgo从质粒或其他多拷贝遗传元件中产生并结合gDNA,然后在同源位点引入双链断裂,并与大肠杆菌外切酶RecBCD一起作用介导DNA降解,这种机制使宿主能够防御入侵的DNA,如质粒和病毒。

加州理工大学StephenL Mayo课题组在Nucleic Acids Research发表了一篇题为 “Genome manipulation by guide-directed Argonaute cleavage” 的研究论文,探索pAgo是否可以成为一种新的DNA引导的基因组编辑工具。

为了验证CbAgo可以定向切割大肠杆菌特定的染色体形成DNA损伤,并诱导RecBCD依赖性染色体重组的发生,作者先将一个“Chi-kanDR- Stop Codons -kanDR-kan C-terminus”表达盒插入到大肠杆菌lacZ基因组后,并设计gDNA靶向lacZ。当且仅当CbAgo切割特定DNA,RecBCD识别Chi位点,减弱其外切酶的切割活性,促进kanDR发生重组删除“Stop Codons”序列,卡那霉素抗性基因恢复功能,使菌株具有卡那抗性。作者进一步发现,添加3个或6个Chi位点的表达盒,RecBCD依赖性染色体重组的发生的几率最大。

最后,作者利用CbAgo替换CRISRER-cas9作为反筛系统,与Lambda-Red重组结合。利用CbAgo去切割未成功发生同源重组双交换的细胞,最终使筛选突变细胞的效率提升了100倍。这些发现证明了使用pAgo建立DNA导向基因组编辑系统的可能性。

原文链接:https://academic.oup.com/nar/article-lookup/doi/10.1093/nar/gkad188

作者:留白

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