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锐谈 | Metab. Eng:适应性实验室进化研究揭示大肠杆菌对化学品的耐受性

锐谈 | Metab. Eng:适应性实验室进化研究揭示大肠杆菌对化学品的耐受性

  • 分类:新闻动态
  • 作者:非非
  • 来源:
  • 发布时间:2023-04-18 15:14
  • 访问量:

锐谈 | Metab. Eng:适应性实验室进化研究揭示大肠杆菌对化学品的耐受性

【概要描述】研究背景 

高浓度的目标化合物是工业生产条件下的主要压力因素,高浓度化合物对宿主细胞有抑制作用,限制后期产物的合成效率。因此,提高菌株的耐受性对于微生物发酵生产具有重要意义,目前提高耐受性的方法有化学/紫外诱变、代谢工程和实验室适应性进化等。

适应性实验室进化(Adaptive laboratory evolution ,ALE)是指通过施加人为干扰及控制微生物生长环境实现微生物进化。与代谢工程相比,ALE不需要考虑菌体复杂、相互交叉代谢网络,只需根据目标设计对应的干扰因素,此方法具有微生物广泛适用性及实用性强的优点,易于发现新机制、实现表型优化。

近期文章“Laboratory evolution reveals general and specific tolerance mechanisms for commodity chemicals”报道了利用自动化平台,将大肠杆菌在11种化学物质中生长,通过基因组测序、逆向工程和交叉化合物耐受性分析来揭示耐受性机制。

11种工业化学品包括1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、戊二酸、己二酸、腐胺、六亚甲基二胺、丁醇、异丁酸酯、香豆素、辛酸和己酸,分属于不同的官能团(图1)。



研究方法与结果 

研究人员利用自动化平台(图2)进化大肠杆菌MG1655自动传代,并分别放置在M9培养基+11种化学品培养条件下,使其实现最佳的生长状态,最后达到比起始毒性水平高60%-400%的耐受性(图3)。



研究人员通过基因组测序,为确定关键的耐受机制,重点关注在至少四个独立品系中突变的基因,而不考虑目标化学品,根据这些标准,在进化后的分离株中,共发现36个基因普遍发生突变,并且突变样式范围十分广泛(图4)。



研究人员发现有30个基因与耐受性直接相关(图5),并根据报道的耐受相关基因的功能和突变类型推断耐受机制(图6),其中19个在ALE条件下针对多种化学类别发生突变的一般耐受基因,和11个特定化学品耐受基因,根据它们的功能,研究人员推断,细胞通过频繁突变来获得对化学品的耐受性,包括膜转运蛋白或细胞壁相关蛋白(例如ProV,KgtP,SapB,NagA,NagC,MreB),转录和翻译机制(例如RpoA,RpoB,RpoC,RpsA,RpsG,NusA,Rho),应激信号蛋白(如RelA,SspA,SpoT,YobF),以及调节剂和酶(例如MetJ,NadR,GudD,PurT)。



研究人员评估了190个分离株对11种化学品在中等毒性水平下的交叉耐受性,发现在三对相似化合物(即二胺、二醇和二酸)上进化的分离株,通常对同一化学类别的其他化学物质具有耐受性(如对角线上方三个方格所示)。即便有几个基因(如rpoC、rpoA、sapB)发生了突变,对辛酸或己酸耐受的分离株对其他脂肪酸不耐受(见对角线底部方格),表明即使是同一基因的突变也可能对化学耐受性产生不同的影响。

对特定化学品的耐受性通常会提高对结构相似化合物的耐受性,而不相似化学品可能会出现折中的情况。

最后还发现,大多数耐受性的分离株在不含化学物质的M9培养基中表现出更高的生长速率,可能是由于适应快速生长的从而发生基因突变(图7)。



研究人员发现使用预先获得耐受性并且预先插入合成途径基因的分离株可以提高化学品的生产能力。用预耐受菌株生产异丁酸酯(IBUA),其目标化学品产量是非耐受菌株的三倍,还用预耐受菌株生产2,3-丁二醇(23BD),20株菌李,其中2株改造菌的产量都有显著的提高。



综上所述,这篇文章基于已鉴定的223株耐受菌株的突变和生长表型,提供了一副综合的基因型-表型图谱。



原文链接: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717623000204

作者:非非




 

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  • 发布时间:2023-04-18 15:14
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研究背景 
高浓度的目标化合物是工业生产条件下的主要压力因素,高浓度化合物对宿主细胞有抑制作用,限制后期产物的合成效率。因此,提高菌株的耐受性对于微生物发酵生产具有重要意义,目前提高耐受性的方法有化学/紫外诱变、代谢工程和实验室适应性进化等。
适应性实验室进化(Adaptive laboratory evolution ,ALE)是指通过施加人为干扰及控制微生物生长环境实现微生物进化。与代谢工程相比,ALE不需要考虑菌体复杂、相互交叉代谢网络,只需根据目标设计对应的干扰因素,此方法具有微生物广泛适用性及实用性强的优点,易于发现新机制、实现表型优化。
近期文章“Laboratory evolution reveals general and specific tolerance mechanisms for commodity chemicals”报道了利用自动化平台,将大肠杆菌在11种化学物质中生长,通过基因组测序、逆向工程和交叉化合物耐受性分析来揭示耐受性机制。
11种工业化学品包括1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、戊二酸、己二酸、腐胺、六亚甲基二胺、丁醇、异丁酸酯、香豆素、辛酸和己酸,分属于不同的官能团(图1)。
研究方法与结果 
研究人员利用自动化平台(图2)进化大肠杆菌MG1655自动传代,并分别放置在M9培养基+11种化学品培养条件下,使其实现最佳的生长状态,最后达到比起始毒性水平高60%-400%的耐受性(图3)。
研究人员通过基因组测序,为确定关键的耐受机制,重点关注在至少四个独立品系中突变的基因,而不考虑目标化学品,根据这些标准,在进化后的分离株中,共发现36个基因普遍发生突变,并且突变样式范围十分广泛(图4)。
研究人员发现有30个基因与耐受性直接相关(图5),并根据报道的耐受相关基因的功能和突变类型推断耐受机制(图6),其中19个在ALE条件下针对多种化学类别发生突变的一般耐受基因,和11个特定化学品耐受基因,根据它们的功能,研究人员推断,细胞通过频繁突变来获得对化学品的耐受性,包括膜转运蛋白或细胞壁相关蛋白(例如ProV,KgtP,SapB,NagA,NagC,MreB),转录和翻译机制(例如RpoA,RpoB,RpoC,RpsA,RpsG,NusA,Rho),应激信号蛋白(如RelA,SspA,SpoT,YobF),以及调节剂和酶(例如MetJ,NadR,GudD,PurT)。
研究人员评估了190个分离株对11种化学品在中等毒性水平下的交叉耐受性,发现在三对相似化合物(即二胺、二醇和二酸)上进化的分离株,通常对同一化学类别的其他化学物质具有耐受性(如对角线上方三个方格所示)。即便有几个基因(如rpoC、rpoA、sapB)发生了突变,对辛酸或己酸耐受的分离株对其他脂肪酸不耐受(见对角线底部方格),表明即使是同一基因的突变也可能对化学耐受性产生不同的影响。
对特定化学品的耐受性通常会提高对结构相似化合物的耐受性,而不相似化学品可能会出现折中的情况。
最后还发现,大多数耐受性的分离株在不含化学物质的M9培养基中表现出更高的生长速率,可能是由于适应快速生长的从而发生基因突变(图7)。
研究人员发现使用预先获得耐受性并且预先插入合成途径基因的分离株可以提高化学品的生产能力。用预耐受菌株生产异丁酸酯(IBUA),其目标化学品产量是非耐受菌株的三倍,还用预耐受菌株生产2,3-丁二醇(23BD),20株菌李,其中2株改造菌的产量都有显著的提高。
综上所述,这篇文章基于已鉴定的223株耐受菌株的突变和生长表型,提供了一副综合的基因型-表型图谱。

原文链接: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717623000204
作者:非非

 

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