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锐谈 | Metab. Eng:酿酒酵母高水平生产麦角硫因的前体供应

锐谈 | Metab. Eng:酿酒酵母高水平生产麦角硫因的前体供应

  • 分类:新闻动态
  • 作者:腊肉那不辣吗
  • 来源:
  • 发布时间:2023-03-27 14:24
  • 访问量:

锐谈 | Metab. Eng:酿酒酵母高水平生产麦角硫因的前体供应

【概要描述】

  • 分类:新闻动态
  • 作者:腊肉那不辣吗
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  • 发布时间:2023-03-27 14:24
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 麦角硫因是一种不常见的含硫氨基酸。它是一种有效的抗氧化剂,在改善神经退行性疾病和心血管疾病方面具有巨大潜力。L-麦角硫因在自然界中很少见,蘑菇是主要的食物来源。化学合成过程复杂且昂贵。
本文,描述了酿酒酵母在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上高水平生产麦角硫因的方法。为此,根据文献选择了氨基酸代谢不同层次的代谢工程目标,并进行了测试。在28个目标中,有9个被发现可以将ERG 产量显著提高10%–51%,然后依次实施这些目标,在小规模培养中产生106.2± 2.6mg/L麦角硫因。
其次,通过转运蛋白工程确定天然Aqr1转运蛋白能够在具有两个ERG生物合成途径拷贝的酵母菌株中增加ERG产量,但在进一步设计以改善前体供应的菌株中则不行。
最后,培养基优化表明额外补充泛酸可进一步提高菌株的生产能力,并且无需补充氨基酸前体。在不补充氨基酸的补料分批发酵中,工程菌株在160小时内产生2.39±0.08g/L的ERG(生产力为14.95±0.49 mg/L/h)。这项研究为低成本发酵生产麦角硫因铺平了道。
1、目标筛选以提高麦角硫因产量
根据生化途径和文献数据,作者选择了27个可能改善ERG前体、组氨酸、SAM和半胱氨酸供应的遗传靶点。每个基因靶标在含有两个拷贝的ERG途径的菌株ST8927中单独实施。对于过度表达,我们在强组成型TEF1p启动子的控制下插入了该基因的额外拷贝。对于缺失,去除目标基因的开放阅读框。在96个深孔板中,在模拟补料分批培养基上筛选菌株,该培养基包含60 g/L Enpump底物和来自Enpump 200试剂盒(Enpresso,柏林,德国)的0.6%试剂a(如图1)。底物是葡萄糖的专有聚合物,葡萄糖单体被试剂中的专有酶裂解。选择补料分批模拟培养基是因为ERG生产的最终过程需要在碳限制补料分批中进行,以避免Crabtree效应。八个基因组编辑使ERG滴度提高了10%-51%。随后,我们通过在24个深孔板中培养相应的菌株来确认增强。
增加ERG产量的八个目标属于氮代谢调节的不同部分。三种基因组编辑属于调节机制,可调节参与氨基酸生物合成和氮转运的大量基因或编码转录因子和调节蛋白的基因的表达。这些基因组编辑用于一般氨基酸控制(GAAC)的GCN4 上游起始密码子(ΔuORF1-4_GCN4)的缺失,氮分解代谢物抑制(NCR)中URE2 的缺失,以及STP1在Ssy1-Ptr3-Ssy5 (SPS)传感器系统中的过表达。改变ERG 生物合成前体可用性的基因组编辑提高了ERG滴度,例如删除ERG4和SPE2以防止SAM的利用,过表达MET14和MET16以改善硫同化和硫氨基酸生物合成,以及删除STR2以防止半胱氨酸转化回同型半胱氨酸。在确定了这八个提高ERG滴度的基因组编辑后,作者试图通过过度表达或缺失以外的方法来增强 ERG 的产生,因此采用了使用有毒类似物生成滴度增加的突变体的传统方法。
2、组氨酸过量生产的麦角硫因生产菌株
化合物β-(1,2,4-triazol-3-yl)-DL-丙氨酸(TRA)是ERG通路前体组氨酸的毒性类似物。TRA抗性突变体可以在不同水平上过量生产组氨酸,从而补充组氨酸营养缺陷型。因此,作者将具有真菌途径双拷贝的ERG产生菌株(ST8927)接种在含有TRA的平板上,以产生组氨酸过量产生突变体。一部分突变体不会过量产生组氨酸,但组氨酸转运发生了改变。因此,使用含有30 mM组氨酸或不补充组氨酸的培养基平行筛选从含有TRA的平板中产生的突变体。在含30 mM组氨酸的培养基中生长的菌落可能是转运蛋白突变体。不在含有30 mM组氨酸的培养基中生长,但在没有补充组氨酸的培养基中生长的菌落随后被筛选组氨酸和ERG生产能力(如图2A)。其中菌落3显示出最高的组氨酸和ERG滴度,分别为283mg/L和61mg/L,并更名为菌株ST9687。并且使用该菌株实施和组合已确定的基因编辑,以提高目标筛选实验中的ERG效价。作者采用全基因组测序来阐明在组氨酸过量生产菌株中观察到的两种不同组氨酸生产水平之间的不同突变,同时进行进一步的代谢工程。图2A中的菌落 4被重命名为ST10280,并且与亲本菌株ST8927相比,确定了菌株ST9687 和 ST10280 中的突变。两种菌株都携带四个突变,UBX4的启动子区域和基因HIS1、BCK1、VBA2在ST9687中发生突变。YBR016W、GAP1、HIS1、TCB2 基因在ST10280中发生突变。然后在亲本菌株ST8927中对突变进行逆向工程,以推断ERG生产菌株中组氨酸过量产生的因果突变。发现只有HIS1中的突变会导致组氨酸的过量产生。此外,两种HIS1突变都允许逆向工程菌株产生与其各自的原始选择菌株相似水平的组氨酸和麦角硫因,ST9687对应HIS1–N231I和ST10280 对应HIS1-T48S。
3、整合过表达基因
在产生组氨酸产量提高的菌株后,目标筛选实验中提高ERG滴度的基因过表达,即MET16、STP1和MET14。所有单独的编辑都提高了仅具有ERG途径的菌株的ERG产量,但只有MET14提高了新的组氨酸过量生产菌株的产量(如图2B)。MET14和 STP1的组合与仅MET14没有显著差异,这与STP1整合本身不显示ERG效价的任何变化一致。所有包含MET16整合的菌株都产生了高特异性滴度,但由于最终生物量减少,滴度较低。因此,作者选择具有MET14过表达的ST9929进行进一步工程化。

4.工程基因的缺失
作者进一步探索了基因缺失对ERG滴度增加的影响,包括ΔuORF1-4_GCN4、Δerg4、Δspe2、Δstr2、Δure2,并且使用迭代循环的方法,将删除单独添加到ST9929菌株中,随后分析ERG(如图2C)。然后为下一轮工程选择性能最佳的敲除,其他删除将插入现有的敲除之上。首先Δspe2菌株对 ERG 产量的提高最大,因此被用作第二轮基因敲除工程的基础。但是,这些缺失都没有进一步提高ERG效价。因此作者选用Δspe2菌株ST10165进行转运蛋白工程(如图2D)。
SPE2缺失将菌株转变为亚精胺和泛酸营养缺陷型。培养基中使用的维生素溶液含有足够菌株所需的泛酸,但亚精胺需要单独添加,如果不补充亚精胺,菌株的表型是生长速率降低,因此,作者探究了不同的亚精胺或酵母提取物补充水平,以找到最佳亚精胺浓度,最终确定选择10 nM亚精胺补充剂作为未来实验的浓度。
5优化培养基以增加ERG产量
针对菌株ST10165的培养基成分进行了优化,以最大限度地提高ERG效价。作者将34种SC培养基成分中对ERG生产的影响使用两级部分因子设计将成分变化5倍进行了研究。ERG生产数据使用方差分析(ANOVA),数据表明,浓度为2 mg/L的泛酸钙显著影响ERG的产生。与基础培养基相比,含有高泛酸钙的培养基组合物可将ERG水平提高多达2倍。此外,所有八种表现最佳的培养基都含有泛酸钙,证实了泛酸钙对ERG产生的积极作用。因此,作者决定为菌株ST10165在生物反应器中的补料分批发酵补充额外的泛酸盐。
6、补料分批发酵
作者将工程菌株ST10165在生物反应器中的葡萄糖限制补料分批条件下培养。额外的泛酸和吡哆醇都被补充到培养基中,通过培养基优化发现吡哆醇是Egt2酶所需的辅助因子,并且之前对ERG的产生有积极影响。在培养160 小时后,ST10165产生2.39±0.08g/L麦角硫因,CDW为68.5±2.9 g/L,对应的生产力为14.95 mg/L/h,产品产量YSP为11.18毫克ERG/克葡萄糖。大约76% ERG 保留在细胞内。

总 结
这项工作描述了在不添加前体的情况下,在酿酒酵母中成功地生产麦角硫因。代谢工程应用于酿酒酵母氨基酸代谢的各个层次,以提高麦角硫因的生产能力。随后,高产组氨酸突变体以获得用于进一步代谢工程的起始菌株。然后在该菌株中实施了提高麦角硫因效价的代谢工程目标。进一步的转运体工程表明,在仅表达ERG生物合成途径的菌株中,Aqr1转运体能够提高麦角硫因的产量,但在进一步改造以改善前体供应的菌株中则不能。最后,优化培养基以生产ERG,并在生物反应器中在葡萄糖限制的补料分批条件下培养该菌株,在160小时内产生2.39±0.08g/L的ERG(生产力为14.95±0.49 mg/L/h)。

原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717622000180?via%3Dihub=

作者:腊肉那不辣吗

编辑:全全

 

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