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锐谈 | ACS OMEGA：理性改造L-哌啶酸羟化酶的可溶性表达

锐谈 | ACS OMEGA：理性改造L-哌啶酸羟化酶的可溶性表达

分类：新闻动态
作者：迪迦
来源：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsomega.2c04247
发布时间：2023-01-11 13:48
访问量：

锐谈 | ACS OMEGA：理性改造L-哌啶酸羟化酶的可溶性表达

【概要描述】

分类：新闻动态
作者：迪迦
来源：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsomega.2c04247
发布时间：2023-01-11 13:48
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利用大肠杆菌构建的异源表达系统在生化研究中有着广泛的应用。

但在表达的过程中，由于错误的蛋白质折叠会导致的被称为“包涵体”的聚集体的形成。

为了解决这个问题，人们已经研究了几种策略来克服这些限制：

1.降低培养温度和改变培养基组分来优化培养条件；

2.密码子优化；

3.与伴侣蛋白的共表达；

4.使用不同强度的启动子来控制蛋白质合成速度。

然而，这些方法也不一定能改善包涵体的问题。

因此，作者Yasuhisa Asano及其团队在《ACS OMEGA》上发表了题为“Rational Design of the Soluble Variant of L‑Pipecolic Acid Hydroxylase using the α‑Helix Rule and the Hydropathy Contradiction Rule”的文章，提出了一个新的改善可溶性表达的方法（图1）：亲水性矛盾法则和α-螺旋法则。

这两个法则均基于共识设计方法（consensus design method）——通过用在同一家族蛋白质中高度保守的残基取代目的蛋白的某些残基来提高蛋白质的功能：

（1）亲水性矛盾法则：

如果靶蛋白的残基是亲水的，而共识蛋白的残基是疏水的，则得分为负，如果相反，得分为正。因此，分数通过将它们与一致的氨基酸残基进行比较来识别具有矛盾疏水性的残基。

（2）α-螺旋法则：

将存在于α-螺旋的亲水区的疏水氨基酸转化为亲水性氨基酸，或将疏水性区域中的亲水性氨基酸转化为疏水性氨基酸。

基于上述两种规则，作者对其蛋白XdPH（来自于Xenorhabdus doucetiae 的2-oxoglutarate-dependent L-pipecolic acid hydroxylase）进行了聚集性预测。并通过分数筛选出了19个为位点进行突变（表一）。

在所有的突变结果中（图二），野生型、V31E、V62D、C76Y和L142R变异体的可溶性部分的活性分别为1.4、2.53、2.51、7.36和20.5 mU/mg可溶性蛋白。其中L142R的活性相对于WT提高了14.6倍。

作者继续以L142R为母本将剩余位点进行双突变（图三），最终得到双突变I28P/L142R活力为79.6 mU/mg，比WT活性提高了55.8倍。

该方法本质上是基于对同家族蛋白氨基酸的保守性分析，无需过于复杂的计算即可得到较好的可溶性改善。

在计算实验条件有限的情况下，可以为可溶性改善提供一个崭新的实验思路。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsomega.2c04247

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